目的:探讨葛根素对子宫内膜RL95-2细胞P450芳香化酶(aromatase P450, P450arom)表达的影响及其对RL95-2细胞P450arom基因表达的调控作用。
方法:将梯度稀释的葛根素在不同时间点加入RL95-2细胞中,分别采用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)检测药物对RL95-2细胞P450arom mRNA表达水平的影响。以人类基因组DNA为模板扩增人P450arom组织特异性启动子2(PⅡ)转录起始位点上游序列。PCR产物定向克隆到报告基因载体pGL3-Basic中,构建人P450arom PⅡ系列报告基因质粒,并经限制性内切酶消化鉴定和基因测序证实。瞬时转染系列重组质粒至RL95-2细胞,加入葛根素刺激,分析相关转录因子,利用RT-PCR及Western blotting方法检测相关转录因子在葛根素作用下mRNA及蛋白表达的变化。
结果:与溶剂对照组比较,低浓度葛根素会抑制P450arom mRNA表达(P<0.01),抑制作用在6、12 h较显著(P<0.01)。经酶切鉴定、基因测序、转录因子分析及启动子活性测定,成功构建了人P450arom PⅡ系列重组质粒(–1 017,–763,–543,–234~+8 bp)。瞬时转染系列质粒至细胞中,于12 h后加入葛根素(10 –7 mol/L)刺激,又12 h后检测荧光蛋白水平。结果表明,–763~–543 bp间的活性被抑制(P<0.05),通过转录因子分析找到了–410/–401 bp的AP-1(c-jun/c-fos)。利用RT-PCR、Western blotting及荧光素酶活性检测发现葛根素(10 -7 mol/L)对AP-1(c-jun/c-fos)的抑制作用平行于对P450arom的作用。
结论:低浓度葛根素对子宫内膜RL95-2细胞P450芳香化酶基因表达的抑制作用很可能是受上游调控转录因子AP-1(c-jun/c-fos)的影响。